- PCR (test) - qual è la tecnica PCR?
- PCR (test) - applicazione del metodo PCR
- PCR (test) e malattia di Lyme
- PCR - risultati. Possono essere falsi positivi?
- PCR - risultati. Possono essere falsi negativi
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La PCR è un test che è stato utilizzato nella diagnosi di molte malattie. Il metodo PCR permette di mostrare la presenza diretta di batteri nell'organismo, e in particolare il suo DNA. La PCR è utilizzata, tra l' altro, in nella diagnosi della malattia di Lyme. Qual è la tecnica PCR? Che cos'è la PCR in tempo reale?
Contenuto:
- PCR (test) - qual è la tecnica PCR?
- PCR (test) - applicazione del metodo PCR
- PCR (test) - Malattia di Lyme
- PCR (test) - risultati. Possono essere falsi positivi?
- PCR (test) - risultati. Possono essere falsi negativi
PCR(reazione a catena della polimerasi) è il metodo principale utilizzato nei laboratori genetici e molecolari. È stato sviluppato nel 1983 da Kara Mullis, a cui è stato assegnato il Premio Nobel nel 1993.
PCR (test) - qual è la tecnica PCR?
Il test PCRconsiste nell'amplificazione multipla (solitamente in 30-40 cicli) di uno specifico frammento di DNA, ad esempio geni codificanti per le proteine di Borrelia, con l'uso dell'enzima polimerasi.
Quindi, per visualizzare il frammento di DNA amplificato, vengono utilizzati speciali coloranti molecolari. La PCR, grazie all'amplificazione di specifici frammenti di DNA, è un metodo ultrasensibile.
Nel metodo PCR, i frammenti di DNA vengono amplificati utilizzando coppie di primer specifici per una data regione del DNA batterico. Ad esempio, le regioni bersaglio della PCR utilizzate nella diagnosi della malattia di Lyme sono geni che codificano per proteine, ad es. 16S rDNA, recA, fla, p66, OspA.
Il materiale biologico da cui è possibile eseguire il test è:
- sangue
- sezione cutanea da eritema migrante
- liquido cerebrospinale
- liquido sinoviale o cartilagineo
- urina
PCR (test) - applicazione del metodo PCR
Oltre alla diagnosi di borreliosi di Lyme, il metodo PCR può rilevare specifici frammenti di DNA di altri microrganismi o esseri umani. Pertanto, il metodo PCR viene utilizzato anche in:
- diagnosi e monitoraggio delle infezioni virali: virus dell'herpes (virus dell'herpes, herpes zoster, Epstein-Barr, citomegalovirus), HIV, virus dell'epatite (HBV e HCV)
- diagnosi e monitoraggio delle infezioni batteriche, in particolare quelle batteriche,che non possono essere identificati attraverso colture, ad esempio tubercolosi
- diagnosi e monitoraggio delle malattie neoplastiche: leucemia, tumore della mammella, tumore del colon-retto, tumore del polmone
- diagnosi di predisposizione al cancro: tumore della mammella e dell'ovaio (geni BRCA1 e BRCA2), tumore del colon-retto (geni APC e CHEK2)
- diagnosi di malattie genetiche: emocromatosi (gene HFE), talassemia (geni HBA1 e HBA2), celiachia (geni HLA)
- test di paternità, che rilevano la compatibilità del DNA del bambino e del padre
Attualmente, ci sono molte modifiche al metodo PCR. Ad esempio, nella diagnosi della malattia di Lyme, vengono utilizzati principalmente i metodi della PCR nidificata (PCR nidificata) e della PCR in tempo reale ( ). Quest'ultimo è un metodo quantitativo e permette di determinare il numero esatto di copie del DNA di Borrelia nel materiale biologico testato
PCR (test) e malattia di Lyme
La base per la diagnosi della malattia di Lyme è il test sierologico. Tuttavia, ci sono situazioni cliniche che possono far sì che questi test siano falsi negativi:
- finestra sierologica, ovvero il periodo iniziale di infezione in cui l'organismo non produce ancora anticorpi IgM e IgG specifici contro Borrelia
- in soggetti immunocompromessi che non producono anticorpi sufficienti
- presenza di immunocomplessi costituiti da antigeni Borrelia e anticorpi specifici per essi e impediscono la rilevazione degli anticorpi con metodi sierologici
Se si sospetta che il paziente abbia sintomi della malattia di Lyme e i risultati del test sierologico sono negativi, può essere eseguito un test molecolare basato sul metodo PCR.
Il DNA delle spirochete Borrelia può essere rilevato nelle prime fasi dell'infezione, poiché il numero di spirochete nei fluidi corporei è quindi il più alto.
Nella diagnosi della borreliosi di Lyme, vengono utilizzati principalmente metodi sierologici come l'ELISA, ma in alcune situazioni cliniche è utile il test genetico mediante il metodo PCR.
Maggiore è il tempo trascorso dall'infezione, minore è la probabilità di rilevare il DNA batterico. Pertanto, in alcuni casi, prima di eseguire il test PCR, i batteri vengono coltivati su terreni speciali per 1-2 settimane e quindi viene eseguito il test.
Questo approccio viene utilizzato in caso di sospetto di malattia di Lyme Lyme e prelievo di liquido cerebrospinale. Nella fase avanzata dell'infezione, è più opportuno eseguire un test ELISA
Il metodo PCR non dovrebbe essere utilizzato nella diagnosi di routine della malattia di Lyme a causa della mancanza di standardizzazionesulla presenza delle varietà Borrelia burgdorferi in Polonia
Tuttavia, in caso di difficoltà nella diagnosi (soprattutto nella fase iniziale della malattia), il risultato del test PCR è utile nel processo diagnostico.
Un risultato positivo del test significa che la presenza del DNA di Borrelia burgdorferi e delle sue varianti è stata rilevata nel materiale testato, ma non spiega se l'organismo sia attivamente infetto. D' altra parte, un risultato negativo non esclude la presenza di batteri nell'organismo
Alcuni laboratori offrono test per la presenza del DNA di Borrelia nella zecca. Tuttavia, il risultato di tale test non è la base per la diagnosi della malattia di Lyme in una persona morsa.
PCR - risultati. Possono essere falsi positivi?
La PCR è un metodo ultrasensibile e allo stesso tempo molto sensibile alla contaminazione. Pertanto, è molto importante nei test basati sulla PCR selezionare un controllo interno appropriato per escludere risultati falsi positivi.
Anche la corretta raccolta del materiale per i test, nonché l'esperienza e l'affidabilità del diagnostico che esegue il test sono di fondamentale importanza.
PCR - risultati. Possono essere falsi negativi
Come in ogni test di laboratorio, anche nel metodo PCR possono comparire risultati falsi negativi. Qui è fondamentale raccogliere il sangue per un anticoagulante appropriato, poiché alcuni di essi, come l'eparina, possono inibire la reazione della PCR.
La raccolta del materiale dopo l'inizio della terapia antibiotica può ridurre l'efficienza della reazione PCR e aumentare la probabilità di risultati falsi negativi.
Va inoltre ricordato che i batteri Borrelia vivono per un brevissimo tempo nel sangue e nei fluidi corporei, perché grazie a speciali recettori penetrano molto rapidamente nei punti "difficili da raggiungere" dell'organismo.
Pertanto, contrariamente alla diagnostica di altri microrganismi, il numero di spirochete Borrelia nel materiale biologico è piccolo, a volte anche al limite della rilevazione del metodo PCR. Questo può anche causare un falso negativo.
Riferimenti
- Dunaj J. et al L'importanza del metodo PCR nella diagnosi della borreliosi di Lyme. Navigare Epidemia. 2013, 67, 119 - 123.
- Diagnostica di laboratorio delle malattie trasmesse da zecche Raccomandazioni del Gruppo di Lavoro: Camera Nazionale dei Diagnostici di Laboratorio, Istituto Nazionale di Sanità Pubblica-Istituto Nazionale di Igiene, Consulente Nazionale in materia di malattie infettive, Dipartimento di Malattie Infettive e Neuroinfezioni , Università di Medicina di Białystok, Società Polacca di Virologia, Varsavia 2014.
- Ružić-Sabljić E. e Cerar T. Progressi nella diagnosi molecolare della malattia di Lyme. L'esperto Rev Mol Diagn. 202217 gennaio (1): 19-30
- Valones M.A.A. et al Principi e applicazioni della reazione a catena della polimerasi nei campi diagnostici medici: una rassegna. Braz J Microbiol. 2009 gennaio-marzo; 40 (1): 1-11.
Karolina Karabin, MD, PhD, biologa molecolare, diagnostica di laboratorio, Cambridge Diagnostics PolskaBiologo di professione, specializzato in microbiologia, e diagnostico di laboratorio con oltre 10 anni di esperienza nel lavoro di laboratorio. Laureato al College of Molecular Medicine e membro della Società Polacca di Genetica Umana, è responsabile delle borse di ricerca presso il Laboratorio di Diagnostica Molecolare del Dipartimento di Ematologia, Oncologia e Malattie Interne dell'Università di Medicina di Varsavia. Ha difeso il titolo di dottore in scienze mediche nel campo della biologia medica presso la 1a Facoltà di Medicina dell'Università di Medicina di Varsavia. Autore di numerosi lavori scientifici e divulgativi nel campo della diagnostica di laboratorio, della biologia molecolare e della nutrizione. Quotidianamente, in qualità di specialista nel campo della diagnostica di laboratorio, dirige il dipartimento dei contenuti presso Cambridge Diagnostics Polska e collabora con un team di nutrizionisti presso la CD Dietary Clinic. Condivide le sue conoscenze pratiche sulla diagnostica e la terapia dietetica delle malattie con specialisti in conferenze, sessioni di formazione e in riviste e siti web. È particolarmente interessata all'influenza dello stile di vita moderno sui processi molecolari nel corpo.